Cell - baserade ELISA- protokoll

ELISA , eller enzymkopplad immunabsorberande analys , används som ett diagnostiskt verktyg i medicin och i biologisk forskning för att kvantifiera mängden av ett specifikt protein . ELISA använder antikroppar för att detektera proteinet av intresse och ett reagens som producerar en färg. Den mängd av färg är relaterad till mängden av protein . Cell Culture

Celler bör placeras i brunnarna hos en 96 -brunnsplatta med 100 mikro- liter av tillväxtmedium och cellerna lämnas att sedimentera över natten . Om du studerar cellernas reaktion på en faktor, bör cellerna serumsvältes under 24 timmar och stimulerades sedan med den faktor som studeras. Addera Fixering och Primary Antibody

Efter avlägsnande av mediet , behandlas cellerna med ett fixativ såsom 3 procent formaldehyd eller metanol. Cellmembranet måste permeabiliseras för att tillåta antikropps att penetrera cellen. Permeabilisering kan uppnås genom användning av 0,1 procent Triton , om metanol har inte tidigare använts . Icke-specifik bindning kan förhindras med användning av 10 procent fetalt kalvserum spätt i fosfatbuffrad saltlösning . Efter avlägsnande av blocket, kan den primära antikroppen appliceras och inkuberades under en timme. Addera sekundär antikropp och fläck

Avlägsna primär antikropp och tvätta tre gånger. Lägga till en sekundär antikropp kopplad till ett detekteringsmedel , såsom pepparrotsperoxidas. Inkubera under en timme. Wash Lägg kemiluminescerande substratlösning . Utveckla och scanna plattan för färgintensitet . Addera