Hur man gör Antikropp Späd för IHC

immunohistokemi ( IHC ) är en specialiserad teknik som används av forskare för att visualisera celler i vävnader som har släppts ut på ett objektglas och färgas med en lämplig antikropp som känner igen ett protein som är unik för den cell eller vävnad under undersökningen. Antikroppsspäd( titreringar ) , skall utföras med de experimentella villkoren i användarens eget protokoll , inte den av antikroppens tillverkaren , eftersom de två inte kan vara identiska . Detta är vad du behöver
Celler för att färga
Antibody
Förtunningsbuffert ( " spädningsmedel " ) katalog Pipetter och spetsar
mikrofugrör
Aluminiumfolie
Lab markörer och rör etiketter
Ice
ljusskyddadslide box
Visa fler Instruktioner
1

Kontrollera och förbereda antikroppen . Kontrollera att antikroppen har tagits upp i rätt värden, och reagerar med den exakta versionen av proteinet (den så kallade isoform , eller splitsvariant ) som håller på att testas . Med pipett försiktigt ta en 10 mikroliter portion av detta och etikett som " personliga lager " .
P Om endast mycket små volymer av antikroppar finns , hoppa över detta steg .

Att hålla en personlig lager av antikroppar är rutin i alla laboratorier eftersom den förhindrar korskontaminering av det ursprungliga beståndet . Dispensera detta till ett ljusskyddat mikrofugrör eller en normal mikrofugrör som är inslagna i aluminiumfolie för att skydda från direkt ljus.

Ha detta rör på is , företrädesvis i en Esky med ett lufttätt lock , igen för att minimera ljus, vilket kan förstöra antikroppen. Anteckna den ursprungliga lager koncentration (t.ex. 100 enheter per ml , 1 milligram per mikroliter och så vidare ) på tuben, inklusive namnet på antikroppen och vilka, om några , buffert det inte späds i (t ex serum , saltlösning, eller vatten).
2

Förbered spädningsbuffert , som också kallas antikropputspädningsmedel . Kontrollera att detta är förenligt med antikroppen och immunohistokemi förfarande som används , till exempel , det bör inte skymma någon fluorescens eller hindra efterföljande märkning sekundär antikropp . Gör en standard immunohistokemi utspädning (även blockeringsbuffert ) genom att blanda 1X fosfatbuffrad saltlösning med 1 % Triton- X100 , 10 % fetalt kalvserum och 0,2 % natriumazid. Addera 3

Titrera antikropp. Med den givna koncentrationen av antikroppar i den personliga lager ( uttryckt som koncentrationsenheter såsom mikrogram per mikroliter ) , fastställa omfattningen av antikroppar som krävs för att få 10 mikrogram antikropp .

Inrätta en spädningsserie genom att pipettera en volym ekvivalent med 2 mikrogram av antikropp (till exempel röntgenmikroliter) i 100 mikroliter av spädningsmedel och blandas noggrant genom pipettering upp och ned. Från denna start utspädning , vidta samma X- mikroliter och lägga det till en efterföljande 100 mikroliter av spädningsvätska . Upprepa detta tills 8-10 spädningar ( eller en serie ) består .

Sista röret kommer därför att ha den lägsta koncentrationen och vara den " mättande " koncentration som kommer att generera den högsta nivån av signalen under experimentet. Emellertid kommer den idealiska koncentrationen vara något mer koncentrerad än detta, så att inte alltför mycket signal alstras , som kan orsaka bakgrunds fel.

Märk rören fullständigt med de nya utspädda koncentrationer.
Addera