Hur man mäter NADH

NAD och NADH är båda pyridinnukleotider involverade i ämnesomsättningen . NADH och NAD är co- enzymer som finns i mitokondrierna , kraftstationerna av cellen. Både NAD och NADH är involverade i cellulära reaktioner såsom andning och fotosyntes , där energi och vätgas genereras . NAD och NADH bränsle biokemiska reaktioner som kräver ett antal enzymer för att producera ATP , den viktigaste energikällani celler . Detta är vad du behöver
celler eller vävnad som studeras
NADH analyssats
Fosfat - saltlösning
Kolsyreis
Värme blocket
96 brunnar
Centrifug
Märkt tuber
Plattläsare
Vortex
Känd koncentration av NADH
Visa fler Instruktioner
analys
1

Tvätta cellerna eller vävnad som studeras med kall fosfat salin , PBS. Extrahera cellerna eller bryta upp vävnad i extraktionsbuffert genom att placera blandningen på torr is under 20 minuter och därefter vid rumstemperatur under 10 minuter. Upprepa .
2

Vortex i 10 sekunder . Centrifugera i en centrifug under 5 minuter för att pelletera celler eller vävnadsrester . Avlägsna supernatanten , vätskefas, och placera vätskan i ett rent rör . Addera 3

Filtrera supernatanten genom ett specialiserat filter för avlägsnande av enzymer som kommer att fördelningen NADH.
4

Ta bort 200 mikroliter , rum i ett rent rör och värme på 60 grader i värmeblock i 30 minuter för att denaturera NAD . Kyl och centrifugera och ta bort vätskefasen . Överför 50 mikroliter i en 96 -brunnars platta ; Varje prov ska vara i två eller tre exemplar . För att bestämma total NAD , NADt , inte värmer .
5

Förbered och lägg cykling mix i 96 -brunnar . Blanda och inkubera under 5 minuter. Tillsätt 10 mikroliter av framkallare och låt inkubera vid rumstemperatur i upp till 4 timmar. Lägg samlad lösning . Läs färgförändring på en plattläsareeller fluorimeter beroende på kit .
Standardkurva och Beräkning
6

Bered en standardkurva genom att ta en känd koncentration av NADH och späda den i extraktionsbuffert . Späd i olika koncentrationer , se till att slutvolymenär densamma som testprov. Plate på samma 96 -brunnsplatta som testprover. Läs optisk densitet .
7

Rita standardkurva grafen med koncentration på X-axeln och optisk densitet på Y-axeln . Ta ett medelvärde av varje testprov och läsa av koncentrationen från standardkurvan grafen.
8

Beräkna NAD /NADH- förhållandet genom att subtrahera totala NAD , NADt , från NADH och därefter division med NADH. < Br > Addera