Test för nukleinsyror sker i medicinsk diagnostik för att upptäcka patogener , såsom virus eller bakterier . Dessa tester är mycket snabbare och därmed göra det möjligt för en läkare att påbörja behandling för en patient som normalt skulle ha fått vänta på bekräftelse av infektion med hjälp av mer långdragna och omständliga antikroppsbaserade analyser . Processen är även känd som en nukleinsyraamplifiering test och innefattar ett förfarande som kallas " omvänd - transkriptas- förstärkning" genom polymeraskedjereaktion . Eftersom detta är ett mycket specialiserat vetenskapligt förfarande , avancerad kunskap och kompetens inom molekylärbiologisk teknik och teori behövs . Saker du behöver
PCR-rör
PCR cycler
Pipetter och filterspetsar
Handskar
Celler
Trizol eller annan RNA-extraktion reagens
PCR-buffert
Taq-polymeras
RT-PCR- primrama vid 1 mg /ml koncentration
RNas-fritt vatten
dNTPs
MgCl2
Slumpmässiga primrar vid 1,8 mg /ml koncentration
Superscript II omvänt transkriptas
Visa fler Instruktioner
bearbetning och beredning av RNA
en
Harvest celler med en RNA- extraktion reagens , såsom Trizol . 1 ml , är tillräcklig för att uppsamla celler från en brunn i en sex - brunnars vävnadsodlingsplatta . Cellerna noggrant pipetteras upp och ner för att homogenisera dem och sedan utföra extraktionsförfarandet enligt beskrivningen i Trizol datablad. Kortfattat, extrahera med kloroform, centrifugera sedan för att separera faserna av DNA -, protein- och RNA. Åter bara den färglösa RNA fasen och fälla det med isopropanol . Efter inkubation , centrifuger det och städa upp den resulterande pelleten med flera etanol tvättar . Därefter återsuspendera pelleten i RNas-fritt vatten.
2
För omvänd transkription , denaturera exakt 5 mikrogram av RNA vid 65 grader Celsius i en 10 mikroliter ( ul ) volym av RNas-fritt vatten , sedan snabbt placera på is . För varje reaktion , kombinera 10 ul av RNA, 3 pl av 10 x PCR- reaktionsbuffert, 2,5
