Felsökning av en tre Fragment Ligation

Ligation är en metod som används i biologisk forskning för att gå skilda DNA-strängar . Förfarandet har förenklats genom användning av kommersiellt tillgängliga ligation kit. En ligering procedur följs i allmänhet av transformation, en process att föra in det sammanfogade DNA i en bakterievektor mottagare , för att klona och förstärka DNA. På grund av komplexiteten av metoden , ofta resultat inte överensstämmer med den önskade produkten och kräver felsökning . Detta är mer dominerande i ett försök att gå med flera fragment, såsom i trippel ligering. Detta är vad du behöver
ligeringskit
Ligation -protokoll
Agarosgel
50 X TBA buffert ( 242 g Tris bas , 57,1 ml isättika , 100 ml 0,5 M EDTA späds till 1 liter med vatten )
Avjoniserat vatten
DNA-rening kit
Visa fler Instruktioner
Felsökning transformation
1

Formulera en lista över stegen i ligation och transformation . Felsökning vetenskapliga protokoll i allmänhet börjar med det sista steget , att arbeta bakåt .
2

Jämför renade DNA-produkt från provet till kontroll-DNA , som medföljer satsen . När väl DNA har omvandlats och klonas i bakterier , kan den isoleras, renas och kontrollerades genom agarosgelelektrofores. Resultaten för elektrofores skulle ange om omvandlingen lyckades. Addera 3

Bestäm bakterieväxt under kloning . De flesta bakteriella vektorer är konstruerade så att endast de med en DNA-insats - kommer att växa på ett medium innehållande ampicillin, eller annat antibiotikum. Dålig tillväxt kunde konstatera att DNA-provet inte framgångsrikt sattes in i vektorn .
4

Kontrollera att ligerade DNA-prov renades , före transformation . Buffert salter och ligering enzymer kan hämma omvandlingen av det införda DNA. Det är också viktigt att säkerställa att ligeringen enzymet inaktiverades genom värme, efter genomförd ligering förfarandet. Aktiv ligas skulle kunna störa transformation .
5

Kontrollera den dag bakterie lager som används för transformation . Gamla bakterieceller förlorar effektivitet över tiden . Så småningom bakteriecellerna är oförmögna att omvandling och kvalitet kloning. En gång har diagnostiserats med omvandlingsprocess , kan du börja analysera ligation förfarandet .
Felsökning Ligation
6

Kontrollera renheten i ditt DNA-prov , före ligering . Salt föroreningar i DNA-provet kan resultera i dålig ligation . DNA-provet skall vara renat och fritt från salter och enzymer , innan den används i ligation .
7

Bekräfta om ändarna av DNA-strängar som ska ligeras är trubbiga eller klibbiga . Ligering används för att koppla samman enskilda strängar med trubbiga ändar eller utstickande ändar efter spjälkning med betecknade restriktionsenzymer. T4 DNA-ligas är ett enzym valt för trubbig ände -DNA - men det kommer också att fungera för DNA med klibbiga ändar . Andra DNA-ligaser kan endast fungera för DNA , efter restriktionsklyvning skapa klibbiga ändar . Det är viktigt att använda rätt ligas för testade DNA.
8

Kontrollera koncentrationen av DNA-prov före ligation . Med hjälp av DNA med hög koncentration orsakar ofta DNA att bli linjär. De kit instruktioner kommer att ge information om rätt mängd DNA för att använda i en ligeringsreaktion .
9

Byt ligas enzym med ett nytt parti . Enzymer är särskilt känsliga vid rumstemperatur och fortsatt frys-tö- cykler. Ligaset kan skadas till följd av ett antal användningar , helt enkelt genom frysning och upptining för många gånger. Vissa kit rekommenderar att ligas alikvoteras i mindre portioner när den först används , för att minska antalet gånger är det frysas .
10

Kontrollera ligeringskit . Ofta problem med ligering använder ett kit som har gått ut eller kommit i kontakt med andra DNA och salter . Addera