Western Blöt Instruktion

Western blot-analys är en välkänd teknik för identifiering av specifika proteiner som isolerats från vävnad . De olika proteinerna först separeras genom laddning och vikt på SDS- polyakrylamidgel och överfördes till ett nitrocellulosamembran . Efter överföring , märkta antikroppar binder specifikt med det önskade proteinet och fotograferas med användning av röntgenfilm eller visualiserades genom proteinspecifikfärgning. Det slutliga resultatet visar mörka band som visar närvaro av det identifierade proteinet. Denna artikel fokuserar på den grundläggande metoden för att utföra Western blot-analys i ett laboratorium kvalificerade för komplexa proteinforskning . Saker du behöver
SDS-polyakrylamidgelelektrofores ( SDS-PAGE) med separerade proteiner
Nitrocellulosamembran
Destillerat vatten
överföringsbuffert ( 30 g Tris, 144 g glycin och 200 ml metanol i en l vatten ) katalog Filtrerpapper , Whatman 3 mm
Laboratorie svamp
Western blot överföringskammare
Laboratorieaggregat
laboratorium kylskåp
Laboratorie agitator
Tris saltlösning ( TBS ) ( 24,2 g Tris-bas , 80 g NaCl i 1 liter vatten ) katalog Blockeringslösning ( 5 procent icke fet torrmjölk i TBS ) katalog Primär antikroppslösning
märkt antikropp konjugatlösning
Alkalisk fosfatas-substratlösning med nitro blå tetrazolium fläck
Fosfatbuffrad saltlösning (PBS ) katalog Gel- imager låda
Visa fler instruktioner
Överför proteiner till nitrocellulosamembran
en

Förbered nitrocellulosamembranet . Membranet ska blötläggas i destillerat vatten i två minuter , sedan placeras in i överföringsbuffertenoch tillåts att dra i fem minuter .
2

Montera en överföring smörgås bestående av svamp /filterpapper /SDS PAGE /nitrocellulosamembran /filterpapper /svamp. Sandwich är justerad så membranet ligger närmare anoden och gelén närmare katoden inuti överföringskammaren . Addera 3

Lägg överföringsbuffert i kammaren så smörgåsen är nedsänkt . Placera kammaren inuti laboratoriet kylskåp. Överföring av protein från gelén till membranet bör utföras vid 4 grader Celsius .
4

Ställ in strömförsörjningen för att överföra proteiner från gelén på membranet . Riktningen för överföringen är mot anoden indikeras av den röda ledningen. Större proteiner gå snabbare som svar på en elektrisk ström och kommer att röra sig först. Nätaggregatet kontrollerar hastigheten av överföringen. Ställ in strömmen till 30 V och 40 mA för en övernattning överföring .
5

isär strömförsörjningen efter överföringen är klar. Gör inte kontakt med överföringsbufferteneller ta bort smörgås medan strömförsörjningen är ansluten .
6

Ta bort membranet från smörgås och inkubera i två timmar i blockerande lösningen . Proteiner i den blockerande lösningen kommer att absorbera in i membranet där inga proteiner som är närvarande. Det kommer att förhindra varje antikropp att binda till membranet där det önskade proteinet inte är närvarande. Addera bindning av antikroppen
7

Inkubera nitrocellulosamembranet med primär antikropp -lösning med användning av en agitator . Membranet måste vara helt nedsänkta i lösningen under åtminstone en timme. Det är acceptabelt att inkubera över natten .
8

Tvätta membranet noggrant för att avlägsna obundna antikroppar . Fyra separata 10 -minuters tvättar med TBS räcker vanligtvis för att avlägsna överskott av antikropp .
9

Inkubera membranet i märkt antikropp konjugerat lösning med hjälp av omröraren . Membranet måste inkuberas under minst en timme. Det märkta antikropp -konjugatet är bundet till alkaliskt fosfatas. Det är ett enzym -antikropp- mix som kommer att känna igen och binda till den första antikroppen. Addera Detektion av Protein
10

Skölj membranet under 10 minuter i PBS fyra gånger . Detta kommer att ta bort återstoden av märkt antikropp -konjugat.
11

Inkubera membranet i alkaliskt fosfatas-substratlösning tills bandmönster visas . Färgämnet i substratlösningen kommer att binda till antikropp-antigen - proteinet i membranet och bildar ett mörkfärgat band. Processen kan vara omedelbar eller kräva upp till 30 minuter innan banden observeras .
12

Linda membranet helt i cellofan och placera den direkt på gel - kameran för att visualisera resultaten . Gelen - kameran kan fotografera de resultat som visas på Western blot- membran . Addera