Cellbaserad ELISA Protocol

ELISA , eller enzymkopplad immunosorbentanalys , används som ett diagnostiskt verktyg inom medicinen och i biologisk forskning för att kvantifiera mängden av ett specifikt protein . ELISA använder antikroppar för att detektera proteinet av intresse och ett reagens som producerar en färg. Mängden färg avser mängden protein . Cell Culture

Celler bör placeras i brunnarna hos en 96 - brunnsplatta med 100 mikro - liter tillväxtmedium och cellerna kvar att sedimentera över natten . Om du studerar cellernas reaktion på en faktor , bör cellerna serumsvultna i 24 timmar och sedan stimuleras med faktor enligt studien . Addera fixering och primär antikropp

Efter avlägsnande av mediet , behandlas cellerna med ett fixativ såsom 3 procent formaldehyd eller metanol. Cellmembranet måste permeabiliseras för att låta antikroppen att penetrera cellen. Permeabilization kan uppnås genom användning av 0,1 procent Triton om metanol inte tidigare har använts . Icke-specifik bindning kan förhindras med hjälp av 10 procent fetalt kalvserum utspätt i fosfatbuffrad saltlösning . Efter avlägsnande av blocket, kan den primära antikroppen appliceras och inkuberades under en timme.
Sekundär antikropp och Stain

Avlägsna primär antikropp och tvätta tre gånger. Lägga till en sekundär antikropp kopplad till en detekterings- medel, såsom pepparrotsperoxidas. Inkubera under en timme. Wash Lägg kemiluminescent substratlösning . Utveckla och scanna plattan för färgintensitet .