Cellytan Biotinylering Protocol

Biotinylering använder förmågan hos lösliga vitaminet biotin för att binda till cellproteiner. Biotin binder till proteinet streptavidin och är därför användbara i cellbiologi att visualisera cellproteiner. Biotinylering tillåter säker märkning av proteiner jämfört med tekniker såsom radioaktivitet och påverkar inte cellens normala funktion. Det tillåter forskare att studera cellproteiner såsom receptorer, och som gör att en större förståelse av sjukdomar och sjukdomsprocesser. Märkning suspenderade celler
celler

Tvätta i iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna föroreningar. Buffertar innehållande Tris och glycin kommer att konkurrera med biotinylering och bör undvikas. För att undvika att biotinylering interna proteiner, kan märkningen utföras vid 4 grader Celsius eller i närvaro av azid. Resuspendera cellerna i PBS och den lösliga biotin, sulfo-NHS-LC-biotin.
Märkning Vidhäftande Cells
celler

Tvätta i PBS och inkubera med en produkt såsom sulfo -NHS-LC-biotin. Cellerna skrapades sedan i en skål och lyserades i en buffert innehållande detergenten Triton-X 100 och preparerades för visualisering.
Förberedelser märkta celler

Efter inkubation centrifugerades cellerna till en pellet och tvättades i PBS. Cellerna återsuspenderas i PBS och renades med IgG Sepharose gel. Det bundna proteinet späds i laddningsbuffert och värmdes till 100 grader Celsius.
Visualisering Celler

Utspädda proteiner kan visualiseras med hjälp av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores (SDS- PAGE) följt av blotting med proteinet och enzymblandningen, streptavidin-pepparrot peroxid. Blöts visualiseras med en kemisk reaktion --- kemiluminescens --- som avger ljus. Specifika uppgifter om biotinyleringen kan bekräftas med antikroppar för proteinet enligt studien. Addera