Hur gör jag Line Up DNA för analys?

Agarosgelelektrofores är den vanligaste metoden för visuell DNA-fragment analys, vilket gör att tekniker att visuellt urskilja DNA-fragment baserat på storlek. Agarosgelen upprätthåller ett magnetfält och, eftersom DNA har en negativ laddning, rör den sig mot den positiva änden av det magnetiska fältet. Mindre DNA-fragment gå snabbare genom gelen och större fragment rör sig långsammare. DNA-fragmenten fluorescerande färgas med ett interkalerande medel känt som etidiumbromid. Detta möjliggör jämförelser av flera elektroforesbehandlade DNA-prov på en gel. Saker du behöver
Agarosgel, 0,7 procent till 2 procent
Tris-borat-EDTA (TBA), tris-acetat-EDTA (TAE), natrium litiumacetat (LA), borsyra (SB) buffert
Etidiumbromid
gelpåföringsfärgämne
geltråg
elektroforeskammare
Handskar
Skyddsglasögon
Pipettera
elektrofores kam
Visa fler instruktioner
Förbereda ett 0,7-procentigt agarosgel
1

Väg upp 0,7 g agaros pulver och sedan placera in i en stor (250 ml) konisk kolv.
2

Lägg 100ml av en 1X (reguljär styrka) buffert (TAE, TBE, SB eller LB buffert) till kolven med agarospulver.
3

Microwave eller värme med hjälp av en Bunsen-brännare för ungefär en minut tills lösningen blir klar och agaros har löst.
4

Ta kolven ur värmekällan och låt det svalna till 55 till 60 grader Celsius.
5

Lägg 1 mikroliter (mikroliter) av etidiumbromid till den kylda agaroslösningen med en lämpligt dimensionerad pipett, vanligtvis 1 ml. Virvla lösningen för att blanda.
6

Häll gelén långsamt i gelen facket, att det skall finnas någon bubbla bildas under denna process. Om det inte finns någon medföljande väl dammar med geltråg, använd maskeringstejp för att bilda dem.
7

Lägg ut en elektrofores kam försiktigt in gelen, garanterar en fast ståndpunkt och i rätt riktning. Elektrofores kammar kan variera kraftigt på antalet tänder som de har. Låt gelen in i ca 25 minuter
8

Sänk ner gelen i samma buffert användes för att framställa agaorse lösning -. I detta fall, en 1X-buffert. Sänk ner gelen i upp till 5 ml löpbuffert.
Förberedelse och lastning av DNA i agarosgelen för analys
9

Transfer 5 och 10 mikroliter av ditt prov (er) från sina reaktionsrören till nya rör. I det fall att du vill använda hela reaktionsblandningen, är ett nytt rör inte nödvändigt.
10

Lägg 0.2X buffert till alla dina färska provrör som innehåller ditt DNA-prov för lastning.

11

Avlägsna elektrofores kam långsamt, se till att du inte bryter gelen eller skapa något utrymme mellan botten av gelén och gelén facket.
12

Lägg fem till 12 mikroliter av en lämplig DNA-markör till den första brunnen som skapas av elektrofores kam. Huruvida en DNA-markör är lämplig beror på storleken av fragmenten du förväntar dig från ditt prov.
13

Load fem till 10 mikroliter av dina prover till de återstående brunnarna och tillsätt en lika stor mängd av samma DNA-markör i den slutliga väl.
14

Placera elektroderna in i elektrofores kammaren genom att koppla trådarna i de respektive ingångarna in i kammaren och ställa in elektroden till 50 till 150 V.

15

Låt gelen köra för en till fyra timmar.
Analys av resultat
16

bort gelén från gelén kammaren och placera den antingen i en UV-rum för visuell identifiering, eller plats i en maskin som klarar att ta ett fotografi av gelén.
17

Mät markörer avstånd av migration i sina brunnar.

18

Plot avstånden mot storleken av banden på semilog rutat papper och rita en bäst anpassad linje.
19

beräkna avstånden av dina okända band.

20

Uppskatta storleken på dina okända band genom att dra en linje upp från den sträcka som dina okända band som möter linjen för bästa passform.
21

Rita en annan linje från denna mötesplats över till storleken axeln.