Hur man gör antikroppsspädningar för IHC

Immunohistochemistry (IHC) är en specialiserad teknik som används av forskare för att visualisera celler i vävnader som har släppts ut på ett objektglas och färgas med en lämplig antikropp som känner igen ett protein som är unikt för cellen eller vävnaden som undersöks. Antikroppsspädningar (titreringar), måste utföras med hjälp av de experimentella förhållanden som anges i användarens eget protokoll, inte att av antikroppen tillverkaren, eftersom de två kan inte vara identiska. Saker du behöver
Celler för att färga
antikroppsbuffert
Spädning ("spädningsmedel") katalog pipetter och tips
mikrofugrör
Aluminiumfolie
Lab markörer och etiketter tube
Ice
ljusskyddat objektglaskassett
Visa fler instruktioner
1

Kontrollera och förbereda antikroppen. Kontrollera att antikroppen har tagits upp i rätt värd, och reagerar med den exakta versionen av proteinet (den så kallade isoformen, eller splitsningsvariant) som testas. Med hjälp av en pipett, försiktigt ta en 10 mikroliter del av detta och etikett som "personlig materiel".
P Om endast mycket små volymer av antikroppar är tillgängliga, hoppa över detta steg.

Hålla en personlig lager av antikropp är rutin i alla laboratorier som den förhindrar korskontaminering av det ursprungliga beståndet. Fördela detta till en ljusskyddat mikrofugrör, eller en normal mikrofugrör som är insvept i aluminiumfolie för att skydda från direkt ljus.

Behåll denna rör på is, företrädesvis i en Esky med ett lufttätt lock, igen för att minimera ljus, vilket kan förstöra antikroppen. Anteckna den ursprungliga lager s koncentration (t.ex. 100 enheter per ml, 1 milligram per mikroliter och så vidare) på röret, inklusive namnet på antikroppen och vilka, om några, buffra det inte späds i (t.ex. serum, saltlösning, eller vatten etc).
2

Förbered utspädningsbufferten, även kallad antikropp spädmedel. Kontrollera att detta är förenligt med antikroppen och immunohistokemi förfarande som används, till exempel, borde det inte dölja någon fluorescens eller hindra efterföljande sekundär antikropp märkning. Gör en standard immunohistokemi utspädning (också den blockerande buffert) genom blandning 1X fosfatbuffrad saltlösning med 1% Triton-X100, 10% fetalt kalvserum och 0,2% natriumazid.
3

Titrera den antikropp. Med tanke på koncentrationen av antikroppar i den personliga lager (uttryckt som koncentration enheter såsom mikrogram per mikroliter), fastställa omfattningen av antikroppar som krävs för att erhålla 10 mikrogram antikropp.

Inrätta en utspädning serie genom pipettering en volym ekvivalent med 2 mikrogram av antikropp (t.ex. X mikroliter), i 100 mikroliter utspädningsmedel och blanda omsorgsfullt genom att pipettera upp och ned. Från denna utgångspunkt utspädning, vidta samma X mikroliter och lägger det till en efterföljande 100 mikroliter spädningsmedel. Upprepa detta tills 8-10 utspädningar (eller en serie) består.

Sista röret kommer därför att ha den lägsta koncentrationen och vara "mättande" koncentration som kommer att generera den högsta nivån på signalen under försöket . Dock kommer den ideala koncentrationen vara något mer koncentrerade än detta, så att inte alltför mycket signal produceras, vilket kan orsaka fel bakgrund.

Etikett rören korrekt med de nya utspädda koncentrationer.
Addera