Hur man mäter NADH

NAD och NADH är båda pyridinnukleotider involverade i metabolismen. NADH och NAD är co-enzymer som finns i mitokondrierna, kraftstationerna av cellen. Både NAD och NADH är involverade i cellulära reaktioner såsom andning och fotosyntes där energi-och vätgas genereras. NAD och NADH bränsle biokemiska reaktioner som kräver ett antal enzymer för att producera ATP, den viktigaste energikällan i cellerna. Saker du behöver
celler eller vävnad som studeras
NADH assay kit
Fosfatbuffrad saltlösning
Kolsyreis
Uppvärmning blocket
96 brunnar
Centrifug
Märkt rören
Plattläsare
Vortex
känd koncentration av NADH
Show More Instruktioner
Assay
en

Tvätta cellerna eller vävnaden som studeras med kall fosfatbuffrad -buffrad saltlösning, PBS. Extrahera celler eller bryta upp vävnad i extraktionsbuffert genom att placera blandningen på torr is under 20 minuter och därefter vid rumstemperatur under 10 minuter. Upprepa.
2

Vortex i 10 sekunder. Snurra i en centrifug under 5 minuter för att pelletera cell eller vävnad skräp. Avlägsna supernatanten, den flytande fasen, och placera vätskan i ett rent rör.
3

Filter supernatanten genom ett specialiserat filter för att avlägsna enzymer som kommer fördelningen NADH.
4

bort 200 mikroliter, placera i ett rent rör och värme på 60 grader Celsius i värmeblock i 30 minuter för att denaturera NAD. Kyl och centrifugera och ta bort vätskefasen. Överför 50 mikroliter i en 96-brunnars platta, varje prov bör vara i två eller tre exemplar. För att bestämma total NAD, NADt, inte värme.
5

Förbered och lägg cykling mix av 96-brunnar. Blanda och inkubera i 5 minuter. Lägg 10 mikro liter utvecklare och låt inkubera vid rumstemperatur i upp till 4 timmar. Lägg stop lösning. Läs färgförändring på en tallrik läsare eller fluorimeter beroende på kit.
Standardkurva och Beräkning
6

Bered en standardkurva genom att ta en känd koncentration av NADH och späda den i extraktionsbuffert. Späd i olika koncentrationer, se slutet volymen förblir densamma som proverna. Plate på samma 96-brunnsplatta som testprover. Läs optisk densitet.
7

Rita standardkurva graf med koncentration på X-axeln och optisk densitet på Y-axeln. Ta ett genomsnitt av varje prov och läs koncentrationen från standardkurva grafen.
8

Beräkna NAD /NADH förhållandet genom att subtrahera sammanlagda NAD, NADt, från NADH och sedan dividera med NADH.
Addera ditt