Hur till testet för nukleinsyror

Provning för nukleinsyror utföres i medicinsk diagnostik för att upptäcka patogener, såsom virus eller bakterier. Dessa tester är mycket snabbare och därmed göra det möjligt för en läkare att påbörja behandling för en patient som normalt skulle ha behövt vänta på bekräftelse av infektion med mer utdragna och tråkiga antikropp-baserade analyser. Processen är också känd som en nukleinsyraamplifiering testet, och innefattar en metod som kallas "omvänd-transkriptas amplifiering" genom polymeraskedjereaktion. Eftersom detta är ett mycket specialiserat vetenskapligt förfarande, avancerad kunskap och expertis inom molekylärbiologisk teknik och teori behövs. Saker du behöver
PCR-rör
PCR cycler
Pipetter och filter tips
Handskar
Celler
TRIzol eller andra RNA-extraktion reagens
PCR-buffert
Taq polymeras
RT-PCR primers vid 1 mg /ml koncentration
RNas-fria vatten
dNTP
MgCl2
Random primers vid 1,8 mg /ml koncentration
SuperScript II omvänt transkriptas

Visa fler instruktioner
bearbetning och beredning av RNA
1-celler

Harvest med en RNA-extraktion reagens, såsom Trizol. 1 ml, är tillräcklig för att uppsamla celler från en brunn i en sex-brunnars vävnadsodlingsplatta. Cellerna grundligt pipetteras upp och ner för att homogenisera dem och sedan utföra extraktionsförfarandet enligt beskrivningen i Trizol datablad. Kortfattat, extrahera med kloroform, centrifugera sedan för att separera faserna av DNA, protein och RNA. Återvinna endast färglösa RNA fas och fällning som med isopropanol. Efter inkubation, centrifuger det och städa upp den erhållna pelleten med flera etanol tvättar. Sedan suspendera pelleten i RNas-fritt vatten.
2

För omvänd transkription, denaturera exakt 5 mikrogram RNA vid 65 grader Celsius i en 10 mikroliter (ul) volym RNas-fritt vatten, sedan snabbt placera på is. För varje reaktion, kombinera 10 ul av RNA, 3 ul av 10 x PCR-reaktionsbuffert, 2,5 ul av 10 millimolar dNTP, 6 liter av 25 millimolar magnesiumklorid, 1 ul av slumpmässiga primrama med 1,8 milligram per milliliter koncentration, och 0,5 ul av SuperScript II omvänt transkriptas enzym. Fyll varje reaktion med 17 ul RNas-fritt vatten. Inkubera rören vid rumstemperatur under tio minuter och därefter vid 42 grader Celsius i en timme för att producera cDNA, därefter denaturera vid 95 grader Celsius och snabbt is för att stoppa reaktionen.
3

För en polymeraskedjereaktion, återigen skapa en reaktionsblandning i 0,5 ml rör genom att kombinera 6 ul av cDNA gjorts i den omvända transkriptionsreaktionen, 1,5 ul av 10 x PCR-reaktionsbuffert, 0,2 mikroliter av Taq-polymeras, 0,5 mikroliter av omvänd primer och även av framåt primer, fyll upp varje rör med 10,3 ul RNas-fritt vatten. Att köra reaktionerna, inrätta en termisk cykler (dvs. en maskin som utför polymeraskedjereaktioner) under 30 cykler enligt följande: 95 grader Celsius under 0,5 minut att denaturera, följt av 60 grader i 45 sekunder för att para, och slutligen 72 grader Celsius under 1 minut för att förlänga den syntetiserade transkript.