Intracellulärt färgningsprotokollet för flödescytometri

Flödescytometri är ett verktyg som är användbart i studiet av cellens proteiner . Det utnyttjar emission av ljus eller fluorescens från proteinerna inom cellen . Antikroppar eller sönder etiketten fluorescens används för att studera specifika proteiner . Flödescytometri används för att diagnostisera ett antal sjukdomar , inklusive cancer, men är också användbart i medicinsk forskning. Fastställande Cells

Celler bör fastställas för att upprätthålla stabiliteten i de intracellulära proteinerna. Ett antal fixativ kan användas, såsom formaldehyd eller iskall aceton . Efter fixering måste cellmembranet som skall permealized att låta antikroppen att komma in i cellen. Detergenter såsom Triton eller NP- 40 , eller iskall metanol kan användas för att göra hål i cellmembranet. I blockeringsbufferten
Staining

Tvätta celler 0,5 procent bovint serumalbumin utspätt i fosfatbuffrad saltlösning, BSA /PBS. Celler inkuberas i blockerande buffert för att minska ospecifik bindning. Lägg primära antikroppen spätts i blockerande buffert och låt inkubera vid rumstemperatur , för optimerad tid . Tvätta med blockeringsbuffert.
Analys

Inkubera den sekundära antikroppen , som är märkt med en fluorescerande etikett, vid rumstemperatur under 30 minuter. För att ta bort obundna celler antikropp tvätta i blockeringsbuffert. Snurra celler i en pellet och sedan återsuspendera i PBS och analysera på flödescytometer .