Vissa celler vidhäfta till botten av petriskålar eller förblir suspenderade i vätskan. Cellerna kan vara av vegetabiliskt eller animaliskt ursprung. Celler som används i vävnad kulturer kan vara primära celler, vilket innebär att de har skördats direkt från en organism, eller en cellinje som har hållits i odling. Cellinjer är ofta cancerceller, och detta måste beaktas vid planering eller tolka experiment.
Treat celler försiktigt
Adherenta celler avlägsnas från sin petriskål för passage genom skrapning eller med ett proteas, allmänt trypsin och EDTA. Skrapning dödar många celler och bör användas endast när de förbereder cellysater (flytande beredningar av cellinnehåll för analys) eller när trypsin /EDTA absolut måste undvikas.
Trypsinizing avlägsnar inte bara de proteiner som fäster celler till skålen men de flesta andra proteiner på membranet av cellen, för. Celler bollen upp och ta lite tid, oftast över natten, för att återupprätta en obligation med skålen. Lägga till en minimal mängd av trypsin - omkring 1 ml för en 25cm2 kolv - skakar kolven under fem sekunder eller mindre att belägga monoskiktet och sedan hälla ut eller aspirera överskottet trypsin kommer att minska mängden av trypsin som monoskiktet exponeras. Låt celler vila i inkubatorn under trypsinization.
Efter att cellerna glida av skålens botten, lägga till media med serum och aspirera lysatet upp och ner i pipett försiktigt. Tillåt lite media för att stanna kvar i skålen som du pipett upp och ner flera gånger för att bryta isär klumpar och få en jämn suspension.
Inte suger bubblor i pipett. Också, inte kraftfullt mix eller virvel cellsuspensionen,. Cellerna är mycket bräcklig i detta balled-up state
att värma inaktivera eller inte värma Inaktivera
När cellodling tekniker var i sin linda, var fetalt bovint serum (FBS) kända för att innehålla komplementproteiner, som är immunsystemet proteiner som lyserar cellerna. Komplementproteiner är inte önskvärda i cellkultur. Heat-inaktivering FBS vid 56 grader i 30 minuter kommer att göra komplementproteiner inaktiva. Förvärmningsanordning FBS till 37 grader C också är tillräckligt för att inaktivera komplement proteiner.
I början, dödade värme inaktivera FBS även mykoplasma och andra föroreningar. Vid den tiden var filtersterilisering utfördes med 0.45um filter. Idag, sterilisera vi filter FBS och media genom 0.1um eller ens 0.04um filter. Ingen mykoplasma kommer slinka igenom det
Detta lämnar oss frågan huruvida värma inaktivera
Värmeinaktivering degraderar alla komponenter i FBS -.. Såsom vitaminer, aminosyror och tillväxtfaktorer -. möjligen under tröskeln för några petiga cellinjer
p Om du arbetar med en långsamt växande eller petiga cellinje, anser filtrera bara sterilisera din FBS. Du kanske tycker att detta ökar robustheten i dina celler.
Upphovsrätt © Liv och hälsa