1. Co-immunoprecipitation (Co-IP) :Co-IP är en allmänt använd teknik för att studera protein-protein-interaktioner. Det involverar immunoutfällning av ett protein (betesprotein) från ett cellysat med hjälp av en antikropp som är specifik för betesproteinet. Det immunutfällda proteinkomplexet analyseras sedan för att identifiera andra proteiner (bytesproteiner) som interagerar med betesproteinet. Co-IP kan följas av olika nedströms analysmetoder, såsom Western blotting, masspektrometri eller immunfluorescensfärgning.
2. Pull-down-analyser :Pull-down-analyser är baserade på principen om affinitetskromatografi. Ett betesprotein immobiliseras på ett fast underlag (såsom magnetiska pärlor eller agarosharts) genom kovalent bindning eller fusion med en etikett (t.ex. GST eller His-tag). Cellysatet eller den renade proteinblandningen inkuberas sedan med det immobiliserade betesproteinet. Efter tvättning för att avlägsna obundna proteiner, elueras och analyseras de interagerande proteinerna (bytesproteiner).
3. Fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) :FRET är en teknik som mäter överföringen av energi mellan två tätt placerade fluoroforer (donator och acceptor). När donator- och acceptorfluoroforerna är nära varandra (typiskt inom 10-100 Å), resulterar exciteringen av donatorfluoroforen i emission av ljus från acceptorfluoroforen. Denna energiöverföring kan kvantifieras och användas för att övervaka protein-protein-interaktioner. FRET kan implementeras på olika sätt, inklusive märkning av proteiner med specifika fluoroforer eller genom att använda genetiskt kodade fluorescerande proteiner (t.ex. GFP och RFP).
4. Biomolekylär interaktionsanalys (BIA) :BIA, även känd som ytplasmonresonans (SPR), är en etikettfri teknik som mäter förändringar i brytningsindex vid gränsytan mellan ett objektglas och en strömmande vätska. Ett av de interagerande proteinerna är immobiliserat på glasytan, och det andra proteinet passerar över ytan. Interaktionen mellan proteinerna leder till förändringar i brytningsindex, som kan detekteras och kvantifieras. BIA kan ge information om bindningsaffiniteten och kinetiken för protein-proteininteraktioner.
5. Isotermisk titreringskalorimetri (ITC) :ITC är en teknik som mäter värmeförändringen i samband med interaktionen mellan två molekyler. När proteiner interagerar frigörs värme antingen (exotermisk) eller absorberas (endotermisk). ITC kan kvantifiera bindningsaffiniteten (Kd) och termodynamiska parametrar, såsom entalpiförändring (ΔH) och entropiförändring (ΔS), för protein-proteininteraktioner.
6. Protein Interaction Arrays :Proteininteraktionsmatriser involverar screening med hög genomströmning av protein-proteininteraktioner i ett mikroarrayformat. Tusentals olika proteiner eller peptider immobiliseras på en fast yta, och bindningen av ett specifikt protein av intresse detekteras med hjälp av märkta antikroppar eller andra detektionsmetoder. Denna teknik möjliggör snabb och storskalig analys av protein-proteininteraktioner.
7. Jäst två-hybrid (Y2H) analys :Y2H-analysen är en genetisk metod som används för att identifiera protein-proteininteraktioner i jästceller. Det innebär att fusionera de kodande sekvenserna av två proteiner till två olika domäner av en transkriptionsfaktor. Om de två proteinerna interagerar, rekonstitueras transkriptionsfaktorn, vilket leder till uttryck av en reportergen. Positiva interaktioner identifieras baserat på tillväxten av jästceller på selektiva media eller kolorimetriska analyser.
Valet av metod för att studera protein-protein-interaktioner beror på de specifika proteinerna av intresse, tillgängligheten av reagenser och utrustning och den önskade informationsnivån. Kombinationer av dessa tekniker kan också användas för att erhålla omfattande insikter i protein-protein-interaktioner.
Hälsa och Sjukdom © https://www.sjukdom.online