Cell Surface Biotinylering Protocol

Biotinylering använder förmågan hos det lösliga vitaminet biotin för att binda till cellproteiner . Biotin binder till proteinet streptavidin och är därför användbara inom cellbiologi för att visualisera cellproteiner . Biotinylering tillåter säker märkning av proteiner jämfört med tekniker såsom radioaktivitet , och påverkar inte cellens normala funktion . Det tillåter forskare att studera cellproteiner såsom receptorer , och som möjliggör en större förståelse av sjukdomar och sjukdomsprocesser . Märkning suspenderade celler

Tvätta cellerna i iskall fosfatbuffrad saltlösning ( PBS) för att avlägsna föroreningar . Buffertar innehållande Tris och glycin kommer att konkurrera med biotinylering och bör undvikas . För att undvika att biotinylering interna proteiner , kan märkningen utföras vid 4 grader Celsius eller i närvaro av azid. Resuspendera cellerna i PBS och den lösliga biotin, sulfo-NHS -LC - biotin.

Labeling Vidhäftande Cells

Tvätta cellerna i PBS och inkuberas med en produkt, såsom sulfo -NHS -LC - biotin. Cellerna är sedan skrapas in i en skål och lyserades i en buffert som innehåller rengöringsmedel Triton - X 100 och förberett för visualisering . Addera Förbereda märkta celler

Följer inkuberingen är cellerna centrifuger till en pellet och tvättades i PBS. Cellerna återsuspenderas i PBS och renades med IgG- Sepharose -gel. Det bundna proteinet späddes ut i laddningsbuffert och värmdes till 100 grader Celsius. Addera Visualisering Celler

proteiner Utspädda kan visualiseras med användning av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores ( SDS- PAGE ) följt av blotting med proteinet och enzymblandning , streptavidin- pepparrots -peroxid. Blott visualiseras med en kemisk reaktion --- kemiluminescens --- som avger ljus . Specifika uppgifter om biotinyleringen kan bekräftas med antikroppar för proteinet som studeras . Addera