Frysförvaring Rutiner

frysförvaring rutiner är de som tillåter celler som ska lagras på obestämd tid genom att använda extrem kyla för att avbryta metaboliska aktiviteter . Det finns två huvudtyper av frysförvaring förfaranden : jämvikts ( konventionell långsam frysning ) och icke - jämvikt eller ultra - snabb nedfrysning ( förglasning ) . Termen förglasning kommer från latinets " glaskroppen " eller glasartad . Båda förfarandena använder kryoskyddsmedel med frostskyddsvätska - stils att förhindra cellskador under frysprocessen . När cellerna fryses eller förglasat , kan de lagras på obestämd tid genom att sänka ner dem i flytande kväve , en extremt kall vätska med en temperatur på -196 C ( -321 F ) . För att återställa metabolisk aktivitet i cellen efter upptining skall giftiga cryoprotectants tas bort från cellen och den normala vattenbalansengradvis återställs när cellen återgår till ett normalt fungerande temperatur . Översikt

Översikt

frysförvaring rutiner är de som tillåter celler som ska lagras på obestämd tid genom att använda extrem kyla för att avbryta metaboliska aktiviteter . Det finns två huvudtyper av frysförvaring förfaranden : jämvikts ( konventionell långsam frysning ) och icke - jämvikt eller ultra - snabb nedfrysning ( förglasning ) . Termen förglasning kommer från latinets " glaskroppen " eller glasartad . Båda förfarandena använder kryoskyddsmedel med frostskyddsvätska - stils att förhindra cellskador under frysprocessen . När cellerna fryses eller förglasat , kan de lagras på obestämd tid genom att sänka ner dem i flytande kväve , en extremt kall vätska med en temperatur på -196 C ( -321 F ) . För att återställa metabolisk aktivitet i cellen efter upptining skall giftiga cryoprotectants tas bort från cellen och den normala vattenbalansengradvis återställs när cellen återgår till ett normalt fungerande temperatur . Addera cell - Specifika faktorer

det förfarande som används för att cryopreserve celler eller vävnad beror på ett antal faktorer inklusive storleken på cellen , mängden cellulär vätska ( cytoplasma ) och komplexiteten hos cellen ( enstaka cell eller vävnad). Celler med en stor mängd av cytoplasma såsom ägg är svårare att cryopreserve än celler med endast rest cytoplasman , liksom spermieceller . Frysförvaring av äggstocksvävnadär mer utmanande eftersom åtminstone tre olika celltyperi olika storlekar finns i äggstocksvävnad , var och en med olika optimala frysbehov. Slow - frysprotokollhar använts med framgång med olika typer av celler . Förglasning närvarande är mest effektiva med encelliga frysning och mindre effektiv med silkespapper , men forskning pågår för att optimera förglasning av vävnader .
Roll Kryoskyddande

cytoplasma en cell innehåller vatten , som blir till iskristaller vid frystemperatur. Då is bildas inuti en cell, är cellen strimlas och dör. Därför måste vätskan i cellen som skall avlägsnas innan det når frystemperaturer för att undvika cellskador. Olika typer av frostskyddsvätska ( kryoskyddande ) fluider kan användas för att dehydratisera cellen före frysning , inklusive glycerol, propandiol, dimetyl sulfoxde (DMSO) , etanol och socker såsom sackaros och trehalos. Den optimala hastigheten för kylning ( och upptining ) beror på typen av kryoskyddande medel som används och på den egenskap hos cellen eller vävnaden att vara (eller som var ) spärras. Kryoprotektanter är giftiga för metaboliserande celler så cell exponeringar mot kryoskyddsmedel vid varmare metabola temperaturer måste minimeras eller undvikas . Vid upptining eller uppvärmning av cellerna , måste kryoprotektanter tas bort helt från cellen innan metaboliska aktiviteten är återställd . Addera Equilibrium Versus Non - Equilibrium Frysförvaring Procedure

Takten frysning beror på huruvida frysprotokollet är jämvikt - eller icke- equilbrium -baserade. För jämvikts typ förfaranden , är den optimala fryshastighetenuppnås när det finns en balans mellan den hastighet med vilken cellen blir uttorkad av vatten och den hastighet med vilken vatten utanför cellen omvandlas till isen scenen . Dessa jämvikts eller långsam frysprotokollbrukar ta timmar att slutföra och en dator används för att köra en programmerbar hastighet och frys för att se till att frys priser är exakt som krävs . Det är vanligtvis en " hold " steg i protokollet nära start för att låta den manuella skapandet av start iskristaller eller " seeding " i vätskan utanför cellerna .

förglasning , är en helt annan inställning till frysning som inte förlitar sig på ramper och uppnå en jämvikt mellan uttorkning och iskristallbildning används . Förglasning är så extremt snabbt att det inte finns tillräckligt med tid för isbildning och det cellulära vätskan omvandlas direkt till en glasartad eller glasfasen , utan att skada cellen. Programmerbara ränta frysar behövs inte eftersom cellen direkt störtade ner i extremt kallt flytande kväve , uppnå en momentan glasartat tillstånd .
Slow - Freeze Procedure

Det första steget i den långsamma frysförfarandeär att exponera cellen för kryoskyddande gradvis stegvis sätt för att långsamt tillåta ekvilibrering av cellen med det kryoskyddande medlet samtidigt frigöra vatten . När cellerna har rensats av majoriteten av cellulärt vatten, är de celler i kryoskyddande vätska placeras i en behållare av något slag, såsom ett sugrör av plast , en glasampull eller en plast vial.The volym vätska som omger cellerna för långsam frysning är vanligen mindre än en tesked och kan bara vara några droppar . Den pre -märkta behållare är fylld , förseglades och placerades i en programmerbar frys, som långsamt sänker temperaturen hos behållaren under en period av minuter eller timmar till mycket låga temperaturer . Efter ett par minuter av kyla , måste start iskristaller bildas inuti behållaren med " seeding " behållaren. Ympning utförs genom användning av ett verktyg (t.ex. pincett ) som har pre- kyld i flytande kväve för att röra behållaren och orsaka iskristallbildning . Denna förrätt kristall initierar kontrollerad iskristallbildning på ett ställe , säkert bort från cellerna . När sådd är klar , kan resten av kylfläns ramper fortsätta. När behållaren når temperaturer mellan -30 och -85 C, kan behållaren som innehåller cellerna doppas direkt i flytande kväve för att slutföra kylning till -196 C. Addera Förglasning

Ultra - snabba icke - jämvikts kylning förfaranden såsom förglasning använda högre koncentrationer av kryoskyddsmedlen kombination med en nästan ögonblicklig fryshastighetuppnås genom att störta celler direkt i flytande kväve . Förglasning kringgår is - kristallbildning fas och förflyttar vatten direkt i en glasliknande fasen. Förglasning uppnår samma slutpunkt som långsam frysning , men vid en hastighet av -3000C/min jämfört 10C/min eller mer. För förglasning , celler vanligtvis placeras på toppen av ett sugrör och överskott kryoskyddsmedlet tas bort och lämnar bara tillräckligt så att cellen håller fast behållaren genom ytspänning , innan kastar sig i flytande kväve . Eftersom frys är så snabb , är varaktigheten av exponering för cryoprotectants mycket mindre , och mycket högre koncentrationer av kryoskyddsmedlen kan tolereras av cellen . Uppvärmningen av cellen för att den återgår till normal metabolisk funktion måste också vara otroligt snabb . Hantering av förglasat prov är mycket mer krävande än långsam frysta prover eftersom även en kort exponering för en temperatur över den i flytande kväve kan starta en oplanerad uppvärmningen och omfrysning , vilket är skadligt för cellen .
< Br >