Felsökning för Gelelektrofores

Polyakrylamidgelelektrofores eller PAGE, är en teknik som vanligen används för separation av organiska molekyler i ett biologiskt prov . Molekyler med lägre storlek och vikt migrera snabbare på en polyakrylamidgel när en elektrisk ström appliceras. Tydliga distinkta band i allmänhet observeras efter den avslutade gelen inkuberas i en viss fläck . Det är en relativt enkel metod . Men avsaknaden av band eller band som smeta ut eller är oren kan tyda på ett problem i ett eller flera steg i förfarandet . Du bör följa grundläggande riktlinjer för att felsöka en gelelektrofores metod när dina resultat är inte som förväntat . Detta är vad du behöver
kvalitetsklass bis : akrylamid eller prefabricerade plattor
Två glasplattor
Akrylamid : Bis
TBE -buffert ( TRIS , borsyra , EDTA ) katalog Strömförsörjning
Övre buffertkammare
Nedre buffertkammare
protein av DNA-prov
TEMED
Ammoniumpersulfat
Gel fläcken
Visa fler Instruktioner
1

Börja med det sista steget i gelelektrofores först och arbeta bakåt. För gelelektrofores, är det sista steget färgningsproceduren används för att observera provbanden. Några problem borde egentligen ske under färgningsproceduren . Emellertid bör pulveriserade fläckar vara väl upplöst i den lämpliga bufferten , innan de användes för att färga en gel. Fastställa den korrekta koncentrationen av färg användes .
2

Kontrollera strömförsörjningen . Frånvaron av banden skulle kunna indikera ström eller spänning inställningen var för hög och proverna migrerade bort gelen . Höga inställningar kan också orsaka provkomponenter för att migrera genom gelen för fort , vilket orsakar dålig upplösning och band som verkar orena . Proverna får inte migrera genom gelen om inställningen matningen är låg . Prover kan också driva från brunnen där de lastades och inte vandrar genom gelen . Addera 3

Kontrollera vätske akrylamid som används för att kasta polyakrylamidgel . Typiskt är den procentuella andelen av akrylamid används för att gjuta en polyakrylamidgel varierar från 5 till 15 procent . Prov som består av större molekyler lastas på en 5 procent gel , eftersom stora fragment gå långsammare på geler med en procentenhet högre akrylamid . Små molekyler lastas på en högre procent gel eftersom en gel koncentration låg inte skulle vara i stånd att lösa mindre prover .
4

Kontrollera de reagenser som används för att polymerisera akrylamid . En polyakrylamidgel bildas genom polymerisation av en flytande blandning bestående av bis-akrylamid och akrylamid. Ammoniumpersulfat och TEMED tillsätts till akrylamid för att katalysera gelbildning. Normalt bör akrylamid visa tecken på polymerisation ( gelbildning ) 15 minuter efter ammoniumpersulfat och TEMED tillkommit. Polymerisering som sker alltför snabbt är resultatet av höga mängder av ammoniumpersulfat . För lite ammoniumpersulfat kan orsaka ofullständig eller ojämn polymerisation .
5

Bekräfta mängden av proverna laddade . Höga koncentrationer av prover kan röra sig långsamt genom gelen och minska band upplösning . Ett provkoncentrationsom är låg kan inte observeras när gelen har målat . Dessa fläckar har begränsningar som att den minsta mängd prov som kan avbildas som en följd av fläckkänslighet.
6

Bekräfta kvaliteten på proverna laddade . Salter och andra föroreningar som är närvarande i ett prov kan påverka rörelsen av provet längs gelén. Elektrofores är resultatet av elektrisk ström som löper genom en gel som innehåller en strömledande buffert; höga saltkoncentrationer i provet kan påverka rörelsen av denna ström genom gelén . Din isolering av ett prov ska innehålla en renings kit som kommer att producera en relativt rent prov .
7

recension litteratur eller det skriftliga protokollet för att avgöra om den rätta PAGE användes för att genomföra experimentet . Den procentuella andelen av akrylamid i PAGE är specifik för storleken på det prov som skall testas. Litteraturen kan också ge specifik information avseende inrättas av strömförsörjningen och andelen prov migration . Addera