Varför behövde du tvätta brunnarna efter varje steg?

Att tvätta mikroplattans brunnar efter varje steg i olika biokemiska och molekylärbiologiska analyser som ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), DNA/RNA-isolering, PCR och Western Blotting är en viktig del av experimentprotokollet. Syftet med tvättstegen är att avlägsna kvarvarande reagens, reaktionskomponenter eller alla föroreningar som kan störa efterföljande steg eller påverka analysens noggrannhet och specificitet.

Här är några anledningar till varför tvättsteg är nödvändiga:

Borttagning av obundna ämnen: Tvättstegen efter tillsats av reagens eller antikroppar hjälper till att avlägsna obundna ämnen, såsom överskott av antikroppar, ospecifika bindningsmolekyler eller reaktionskomponenter som inte fångas in eller binds till den fasta fasen. Detta säkerställer att detekteringssignalen är specifik och fri från bakgrundsstörningar.

Minimering av korskontaminering: Tvättstegen minskar effektivt risken för korskontaminering mellan proverna. Detta är särskilt viktigt när flera prover bearbetas samtidigt, eftersom det förhindrar överföring av reaktionskomponenter eller föroreningar från en brunn till en annan. Tvättning hjälper till att bibehålla integriteten och noggrannheten hos individuella provresultat.

Effektivt avlägsnande av störande ämnen: Tvättning är nödvändig för att ta bort ämnen som kan störa efterföljande steg. Till exempel, i en ELISA-analys, hjälper tvättning till att eliminera obundna konjugat-antikroppskomplex, vilket minskar bakgrundsfärgutvecklingen och förbättrar specificiteten för den kolorimetriska reaktionen. I PCR tar tvättning bort nukleotider, primrar och polymeraser från tidigare amplifieringscykler, vilket minimerar risken för överförd kontaminering och säkerställer korrekt amplifiering i nästa cykel.

Standardisering och reproducerbarhet: Genom att följa standardiserade tvättprocedurer säkerställer forskarna att förhållandena är konsekventa över experiment och mellan olika laboratorier. Denna konsekvens är avgörande för att erhålla tillförlitliga och reproducerbara resultat.

Tvättproceduren kan innebära att man använder en flerkanalspipett eller en automatiserad platttvätt för att dispensera och suga upp tvättbufferten. Tvättbufferten är vanligtvis en buffrad saltlösning som liknar sammansättningen av den ursprungliga bufferten som användes i analysen, men som inte innehåller några reaktionskomponenter.

Tillräcklig tvätt utan övertvätt är avgörande. Övertvättning kan resultera i förlust av väsentliga komponenter bundna till den fasta fasen och påverka analysens känslighet. Därför är tvättprotokoll noggrant utformade för att uppnå optimalt avlägsnande av oönskade ämnen samtidigt som integriteten hos de immobiliserade molekylerna eller analyterna av intresse bevaras.